正畸力作用下炎性牙周组织中白介素-8的表达(2)
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1材料和方法
1.1 主要试剂和仪器：兔抗鼠IL-8多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，SP-9001免疫组化检测试剂盒、DAB显色试剂盒、0.01M PBS缓冲液(PH7.2～7.4)(北京中杉金桥生物技术有限公司)，胰蛋白酶(Sigma公司，美国)，4%多聚甲醛、0.5mol/L EDTA；0.012"正畸用Ni-Ti拉簧(北京有色金属公司)、0.20mm结扎丝(杭州新亚齿科有限公司)，正畸用弹簧测力计、牙科慢速涡轮机、细金刚砂车针，石蜡切片机(LEICARM 2135切片机，德国)，光学显微镜(Olympus，日本)，电子天平、超纯水仪(Startorius公司，德国)，Motic BA400自动显微镜(上海精密仪器厂)，Motic图像分析系统软件3.2版、Motic Med6.0数码医学图像分析系统(麦克奥迪实业有限公司)。
1.2 实验动物及分组：SPF级健康雄性10周龄SD大鼠35只，体重(200±20)g，由新疆医科大学实验动物中心提供，合格号:SCXK(新)2003-0001，由新疆医科大学第一附属医院实验动物中心(该中心经AAALAC International认证，编号为001279)提供实验动物平台。5只作为空白对照组，其余30只建立实验性牙周炎模型4周后，去除牙周刺激物后随机分为6组，分别为牙周炎对照组，炎症加力1、3、5、7、14天组，每组5只，分笼饲养，自由摄食，适应性喂养1周后开始实验。
1.3 牙周炎大鼠正畸牙移动模型的建立：加力大鼠腹腔内注射(盐酸氯胺酮100mg/kg、安定5mg、阿托品0.5mg混合稀释至10mL，以0.75mL/100g的剂量)麻醉大鼠，并固定于鼠板上。用安装尖头金刚砂车针的牙科慢速手机，在上颌中切牙唇舌、远中面及第一磨牙近中轴角的颈缘处各制备一深约0.5mm的浅沟，用0.25mm正畸结扎丝在上颌切牙和第一磨牙之间结扎镍钛拉簧(长6mm、直径0.3mm)力值约为0.49N，以上颌中切牙为支抗，拉第一恒磨牙向近中移动。每天查看加力装置，发现脱落立即重新安装。牙周炎对照组大鼠不作处理(如图1～2)。
1.4 标本制备：分别在预定时间点以4%多聚甲醛经心内灌注处死各组大鼠，处置方式符合动物伦理学标准。取实验侧3颗磨牙及周围牙周组织，4%多聚甲醛继续固定24h后，置于0.5mol/L的EDTA脱钙6周，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，沿上颌骨矢状向切片，片厚5μm，裱于APES片上，分别进行苏木精-伊红染色及免疫组织化学染色。
1.5苏木精-伊红染色：二甲苯脱蜡10min，2次；梯度乙醇脱水各3min，蒸馏水冲洗3min。苏木精染色10min，蒸馏水冲洗3min，盐酸乙醇分色，蒸馏水冲洗。1/400氨水返蓝10s，伊红染色5min，脱水、透明，封固。采用Motic BA400自动显微镜，由不知实验设计及分组情况的同一病理医师读片，观察标本中第一恒磨牙牙周组织后描述结果，并进行图像的采集。
IL-8免疫组织化学染色：石蜡切片常规脱蜡至水，体积分数3%过氧化氢闭光浸泡20min，蒸馏水冲洗3次，37℃胰消化法修复抗原20min，蒸馏水冲洗3次，PBS溶液冲洗2次。加入兔抗大鼠IL-8多克隆抗体(1:100)，4℃冰箱过夜，PBS溶液洗2次，滴加生物素化二抗，37℃30min，PBS溶液冲洗2次。DAB显色，苏木精复染，脱水、透明，封固。
1.6 结果判定：经免疫组化染色后，采用Motic BA400自动显微镜，由不知实验设计及分组情况的同一病理医师读片。染色结果判定标准：IL-8阳性染色为棕褐色颗粒，定位于细胞质。在低倍镜下观察各组实验侧第一磨牙近中根压力侧根中1/3区域牙周膜内IL-8的表达情况，选择表达较集中的5个视野，换高倍镜采用Motic Image Advanced分析软件3.2版计算IL-8在牙周组织中表达的阳性细胞的面密度值，取均值。将各实验组结果分别与PBS代替一抗的空白对照进行对比观察后，进行图像的采集。
1.7 统计学分析：对所测数据采用SPSS17.0软件包，采用独立样本t检验进行统计分析，计量资料以x±s表示，P<0.05具有统计学差异。
2结果
2.1 牙周炎大鼠上颌第一磨牙牙周膜组织内IL-8的表达：健康大鼠牙周中，IL-8仅在牙周膜成纤维细胞胞浆中中少量弱表达，第一磨牙近中根压力侧IL-8表达的阳性细胞面密度值为7.96±1.32。牙周炎大鼠牙龈结合上皮及沟内上皮变性糜烂，出现破骨细胞，牙周组织中IL-8表达明显增强，阳性染色范围广泛，牙周膜成纤维细胞、破骨细胞表达呈阳性，第一磨牙近中根压力侧IL-8表达的阳性细胞面密度值为15.57±1.15。牙周炎对照组与空白对照组比较，表达强度高，差异有统计学意义，P<0.05(如图3～4，见表1)。
2.2牙周炎大鼠正畸力作用下牙周组织中IL-8的变化规律：牙周炎大鼠正畸力作用下牙周组织中IL-8的变化规律见表1。由表1可见，牙周炎加力组：加力后IL-8阳性表达增强。加力1天后，压力侧牙槽骨出现透明样变区及骨吸收陷窝；牙周膜成纤维细胞内IL-8免疫组化染色阳性反应逐渐增强。3天组压力侧牙槽骨骨吸收陷窝增多，破骨细胞增多；牙周膜成纤维细胞IL-8表达呈阳性且明显增强。5天组压力侧牙槽骨破骨细胞活跃；IL-8在牙周组织内的表达也达到峰值，在牙周膜成纤维细胞、破骨细胞内表达呈强阳性。7天组压力侧牙槽骨破骨细胞减少，透明样变区减小；IL-8在牙周组织内的表达开始下降；14天组牙槽骨以成骨明显，破骨细胞明显减少；IL-8在牙周组织内的表达继续下降(如图5～14)。
2.3 IL-8在牙周组织中表达的半定量分析：在牙周组织中，各实验组IL-8表达的阳性细胞面密度值(Area Density,AD)结果见表1，如图9。牙周炎对照组大鼠第一磨牙牙根压力侧成纤维细胞胞浆内IL-8呈少量阳性表达，正畸力作用下，压力侧牙周组织中IL-8的表达增强，呈先增后减的规律，加力第5天达到峰值，7天时开始减弱，14天时IL-8表达持续降低，表明随着时间的延长，周膜内环境处于恢复及重建状态。炎症加力1、3、5、7天组与牙周炎对照组比较，具有统计学差异(P<0.05)，炎症加力14天组与空白对照组比较，IL-8在牙周组织内的表达继续下降，但强度高于正常对照组，具有统计学差异(P<0.05)。
3讨论
正畸牙齿移动是一个复杂的生物学过程，它是由许多不同的组织、细胞和分子共同作用的结果[4] ......
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