低温快速成型个性化组织工程活性支架的制备及性能分析(2)
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1材料和方法
1.1 制备山羊的颅骨标准骨缺损模型[1]：选取雄性中国青山羊(中国协和医科大学整形外科医院动物实验中心)，颅顶正中切口显露颅顶骨，在中央造成直径为2.2mm骨与骨膜圆形缺损。术后即刻行颅骨CT扫描，三维重建。
1.2 PLGA/TCP复合人工骨支架材料的快速成型制造
1.2.1 制备支架材料匀浆：PLGA(中国科学院化学所)固体研磨粉碎，加1, 4一二氧六环溶液(西安化学试剂厂)充分溶解。加入TCP(钙磷比为1.5:1)粉末(上海试剂四厂)，充分混合，PLGA:TCP=7:3。
1.2.2山羊标准颅骨缺损修复体支架材料的成形过程：清华大学激光快速成型中心开发研制的低温挤出成形设备-快速成型机TissFormTM 的基本原理：将复杂的三维实体的成形离散为一系列二维层片的逐层成形和堆积过程[2-3]。快速成型机的主要部件由储料罐、喷头和位于低温成形室内的工作台组成(图1)。
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山羊颅骨缺损三维CT重建图像重构处理，得到缺损区电子模型(图2)。对缺损模型行数据处理，获得控制喷头扫描的NET文件。如图3所示将制备的PLGA/TCP匀浆加入储料罐中，在NET文件的控制下，喷嘴先沿X轴方向进行N层扫描，喷嘴的直径为0.3mm，工作台下移0.15mm (h值)，喷嘴改为沿Y轴方向进行N层扫描，浆料垂直落于上一层材料上，将其稍作溶解融合之后冻成固态，依此步骤，喷嘴分别沿X轴方向和Y轴方向交替往复进行扫描填充，完成Z层后制造结束，N是由支架材料的每轴扫描层数数据所规定的，例如图4中所成形的材料的N=3 。通过调整细丝间的距离((d值)控制网格的大小，决定了孔隙在水平和竖直截面内的尺寸大小，细丝的长度决定支架材料的外形，参数Z和N决定支架材料的厚度。
将冷冻状态的PLGA/TCP支架材料置于Alphal-2型冷冻干燥机(德国Martin Christ公司生产)500Pa负压下冷冻干燥38h，有机溶剂在真空环境中升华，在材料的细丝上形成微小的孔隙，而大的孔隙是成形过程中规定的。到此，多孔的PLGA/TCP山羊标准颅骨缺损修复体支架材料制备完成，如图5所示，为圆形略有弧度的山羊颅骨人工骨支架材料，成形参数：d值=0.8mm ，N=30。
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1.3 复合rhBMP-2制备活性组织工程支架：支架材料残留微量机溶剂，会对细胞的生长起到毒害作用。因此使用前支架材料置入医用95%的酒精中浸泡24h，去离子水清洗浸泡48h。低温烘干，塑料袋密封，环氧乙烷消毒[4]。将净化消毒的PLGA/TCP支架材料浸泡于75%酒精中30min，去离子水中30min，再用去离子水中漂洗3次，离心排除大部分水份。在湿化的支架材料上均匀取三点作为复合点，每点滴加8μl NaH2PO4，随即滴加66.7μl rhBMP-2溶液，每个支架共复合lmg rhBMP-2。将支架材料置入无菌试管，软塞密封，注射器反复抽吸，促进rhBMP-2向材料内部渗透吸附。在冻干机内冻干，密封，4℃冷藏备用(图6)。
1.4 孔隙率的测定：采用排液法测定材料的孔隙率。选择乙醇为液体用于PLGA/TCP支架材料孔隙率的测定。
1.5 扫描电镜观察：分别取PLGA/TCP支架材料的径向面和横断面，抽气处理后，直接在电镜下进行观察。
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1.6 力学性能分析：采用美国Rheometric Scientific公司生产的Minimat 2000型微型材料试验机测定支架的压缩力学性能。采用1000N载荷量，加载速度为1 mm/min，选择的外观尺寸为6.5mm×6.5mm×13.5mm，共测试6个样品。PLGA/TCP人工骨支架的测量值压缩弹性模量(17.87±2.0l)MPa和抗压强度(0.68±0.08)MPa测得的数据与成年人股骨和腰椎的力学性能进行的比较 (表1) 。
2结果
2.1 大体观察：快速成型制备的PLGA/TCP人工骨支架材料圆形略有弧度，与颅骨缺损的形态非常吻合。肉眼可见材料密布径向分布大的孔隙，呈网格状(图5)。
2.2 孔隙率的测定：选择乙醇为液体用于支架材料孔隙率的测定，乙醇能够充分地浸润PLGA/TCP，而且不会改变PLGA/TCP支架材料物理及化学性状，测得多孔支架结构的孔隙率为89.6%。
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2.3 支架材料的扫描电镜观察：材料径向面、横断面密布类圆形和椭圆形的大孔结构，大孔呈径向分布，平均大小约为360μm，相互贯通，孔径较为光滑，没有尖锐的突起，孔壁的平均宽度300μm。在大孔的周围、内部以及材料丝上布满了的微孔结构，微孔也是相互贯通，外型多为近似圆形，孔径大小约为3～5μm (图7) 。
复合rhBMP-2的PLGA/TCP复合人工骨在大孔周围的材料细丝中存在大量的微孔结构，在大孔及微孔中都吸附着大量的相应大小的rhBMP-2微粒，分布较为均匀。从材料断面的扫描电镜照片可以看到在材料的内部的微孔上也同样吸附着rhBMP-2微粒 (图7) 。
2.4力学性能分析：见表1。
3讨论
3.1支架材料制造工艺分析：目前有多种骨组织支架成形方法。传统方法有固液相分离法[5-6]、气体发泡和溶盐法[7]等。这些工艺适合制备孔隙直径为200μm以下的可控孔隙结构，但很难制备直径为200～500μm之间的可控孔隙结构。基于快速成形原理的骨组织支架成形方法，主要有立体光固化工艺[8]、熔融沉积工艺[9-10]和三维打印工艺[11]。这些快速成形方法可以很好地加工出数百微米的孔隙结构，但难以成形更小的孔隙。
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本研究采用一种制造PLGA/TCP复合人工骨支架材料的新型快速成型工艺[12-13]，即低温挤出快速成形工艺，在可控孔隙结构和用户化植入物的制造方面有传统支架材料成形工艺等不可比拟的优势。制造的支架材料孔隙率和孔隙大小是可以在制造时进行预先规定的，通过控制每条原料细丝的间距，可控制大孔结构的大小与走形方向；控制喷嘴的大小来改变原料细丝的粗细，可控制材料的孔隙率和材料的力学强度，并可影响小孔结构的大小。其制备的材料，具有平均大小约为360μm的大孔结构。在大孔的周围布满了相互贯通的微孔结构，外形多为近似圆形，微孔径大小约为3～5μm，孔隙间相互贯通，孔隙率89.6%，其立体结构符合骨组织工程的要求。在临床中同样依此步骤，将制造出个性化具有三维复杂内结构的修复体。
另外，立体光固化工艺[8]、熔融沉积工艺[9-10]和三维打印工艺[11]的成形过程由于存在热相变等过程，对生物材料的性能尤其是生物活性有不可避免的影响。低温挤出快速成形工艺采用非加热的方式液化原料，并在低于0℃的环境中堆积成形，在成形过程中可以很好的保持材料的生物学性能。即使是对温度非常敏感的一些生物活性蛋白，经过这样的处理过程，其生物活性也不会受到影响。所以使在成形过程中直接加入生长因子等活性物质成为可能。
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除了成形的多孔支架材料在力学上和人皮质骨有较大差距这一缺点外，低温成形不是即刻的，制造工艺需要一定的时间，精细度仍需要进一步调整。rhBMP-2的复合还不能在成形过程中进行。
3.2 材料的选择：本实验选择TCP和PLGA搭配，基于如下考虑：①将TCP引入PLGA使TCP颗粒镶嵌于PLGA中，改善材料亲水性，提高PLGA与细胞的亲和性；②TCP钙/磷比为1.5:1，接近正常骨组织，并且其降解性优于其他生物陶瓷，同时TCP具有良好的骨传导性能和生物相容性[14]；③PLGA降解后在局部积聚的酸性代谢产物对细胞有一定的毒副作用。TCP降解后呈弱碱性，可中和PLGA的酸性降解产物，弱化对细胞的毒性作用，增加材料的细胞相容性；④TCP和PLGA各自在动物体内完全降解的时限与骨折自然愈合时间相接近，有利于成骨与降解速率的匹配；⑤TCP的降解过程中，局部Ca2+和PO44-浓度增加，在TCP植入体的表面形成一个碳酸磷灰石结晶层，从而刺激骨组织的再生[15]。, 百拇医药(雷 华 余 东 唐晓军 张志勇 俞 冰 牛 峰 归 来)