贲门癌与p15基因甲基化关系研究
【摘要】 目的 探讨p15基因异常甲基化与贲门癌变的关系，探索其在临床早期基因诊断和治疗中的意义。方法 采用甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)法检测76例贲门癌患者癌组织与相应癌旁组织以及远癌正常胃粘膜的p15基因甲基化状态。结果 贲门癌患者癌组织p15基因启动子区甲基化阳性率为(18.1%)，癌旁组织p15基因启动子区甲基化阳性率为(5.6%)，而远癌正常胃粘膜均为非甲基化。结论 p15基因可通过甲基化而失活，可能与贲门癌的发生发展有关，其与p15基因表达的关系尚需进一步深入研究。关键词 贲门癌 p15基因甲基化 MSP
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)08-0693-03
Analysis on the methylation of p15gene in gastric cardia cancer from the subjects at high-incidence area for gastric cardia cancer in henan Xie Dongling，
, 百拇医药
Wang Lidong，Li Jixue，et al.
Laboratory for Cancer Research，College of Medicine，Zhengzhou University，Zhengzhou450052.
【Abstract】 Objective To explore the relationship between the aberrrant methylation of the p15gene CpG isˉlands and gastric cardia cancer.Methods The level of the methylation of p15gene CpG islands in76cases of gastric cardiac cancer and matching adjacent non-cancer tissue and normal tissue were analysised by using methylation-specific PCR methods.Results p15gene CpG islands aberrant methylation were detected in18.1%gastric cardia cancer while were methylated in4cases(5.6%)adjacent non-cancer tissue and unmethylated in all normal issue.Conclusionp15gene can be inactived by CpG islands aberrant methyation，which perhaps actsan important role in the carcinogenesis of gastric cardia cancer.The relationship of methylation and p15gene expression remain to be furˉther studied.
, http://www.100md.com
Key words gastric cardical cancer p15gene methyation MSP DNA
甲基化是哺乳动物最普遍的一种基因外调节方式，是Epigenetics(表遗传学或拟遗传学)上研究最深入的一种机制，现已确切证明DNA甲基化与肿瘤的发生发展密切相关。p15是近年来发现的一类CKI分子(cyclin dependent kinase inhibitor，CKI细胞周期引擎分子的抑制剂)之一，能特异地与cylinD/CDK4或cylinD/CDK6结合并阻抑它们的活性，作为细胞生长负调节因子，控制细胞G 1 /S期的转移 [1] 。本文针对p15基因启动子区设计引物，对经过化学修饰的DNA进行PCR扩增，探讨p15甲基化与贲门癌变的关系。
1 材料与方法
1.1 材料 本研究所采用组织材料均来自河南贲门癌高发区林州市当地居民，包括76例贲门癌癌组织、相应癌旁组织以及远癌正常胃粘膜，所有标本参照组织病理学论断标准病理证实 [2] 。其中男53例，女23例，平均年龄56岁。所有患者术前均未接受化疗和放疗。
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1.2 DNA的制备 每例分别取癌、癌旁3cm新鲜冰冻组织
以及远癌正常胃粘膜各10mg，置于研磨器中加入液氮研成细沫状态，DNA提取采用Gentra公司的Puregene TMDNAIsoˉlation Kit，操作按说明书进行。提取的DNA用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测，所有样品均有DNA亮带。
1.3 甲基化特异性PCR(MSP) 在亚硫酸氢盐的作用下，所有未甲基化的胞嘧啶发生脱氨基反应转变成了尿嘧啶，但是5-甲基胞嘧啶不发生转变。因此，如果DNA原始甲基化情况不同，处理后DNA序列将不一样。经过化学修饰的DNA进行PCR扩增，甲基化特异引物可以扩增修饰前有甲基化的DNA，而非甲基化引物对这样的DNA不能扩增出条带。相反，非甲基化引物可以扩增修饰前没有甲基化的DNA，而甲基化对这样的DNA不能扩增出条带。根据上面的原理，就可以由引物判断原来DNA的甲基化状态。在实际操作中常常会有甲基化与非甲基化条带同时出现的情况，这是因为在异常甲基化的细胞中掺杂了正常的或炎性的没有甲基化的细胞，或者是肿瘤细胞中的一个等位基因发生了甲基化而另一个没有甲基化，称之为半甲基化状态(Hemi-methylation)。
, 百拇医药
1.3.1 DNA修饰 本实验采用Intergen公司的CpGenome TM DNAModification Kit对DNA进行甲基化修饰，操作步骤按说明书进行。
1.3.2 引物 PCR引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。引物参考文献 [3] ，上游引物在288碱基处，下游引物在458碱基处。甲基化上游引物为5′-GAT CGG TCG TTC GGTTATTG-3′，下游引物为5′-CTT ATT CTC CTC GCG CATTC-3′，扩增片段约为207bp;非甲基化上游引物为5′-GTT GTT TGG TTA TTG TAT GGG-3′，下游引物为5′-CCC TTA TTC TCC TCACAC AT-3′，扩增片段约为204bp。
1.3.3 PCR扩增 扩增反应总体积为25μl:10×Buffer(100mM Tris-HCl pH8.8，500mM KCl，0.8%Nonidet P40)，25mMMgCl 2 (购自MBI Fermentas公司)，2.5mMdNTP(each)，5%DMSO，上下游引物各反10pmol，2UTaq DNA Polymerase(20mM Tris-HCl pH8.8，1mM DTT，0.1mM EDTA，100mM KCl，0.5%Nonidet P40，0.5%Tween20，50%Glycerol)，100ng DNA。反应采用touchdown PCR:95℃预变性5min，95℃30s，65℃30s，72℃30s，之后每个循环递减0.5℃，共30个循环，72℃延伸10min。为了保证检测的可靠性，以经过SssI甲基转移酶处理过的胎盘DNA作为p15基因启动子甲基化的阳性对照 [4]。以双蒸水代替模板作为阴性对照，扩增产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳(50V，30min)，EB染色，紫外灯下拍照。
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2 结果
贲门癌及癌旁组织甲基化水平检测结果。72例癌组织中有13例甲基化阳性，占18.1%，基中半甲基化5例;癌旁组织中有4例甲基化阳性，占5.6%，基中半甲基化3例;20例正常胃粘膜组织均为非甲基化。
图1 MSP检测贲门癌及癌旁组织中p15基因甲基化状态1:DNA标准分子量DL20000;3、5、7:甲基化扩增产物，其中5为阳性对照;2、4、6、8:非甲基化扩增产物
3 讨论
p15基因是p16家族成员之一，定位于染色位9p21的肿瘤敏感区域。大量肿瘤以及多种癌细胞系中的调查表明，p15基因的异常表达(如缺失、突变和重排等)在许多肿瘤及癌细胞系中存在，并与其中一些肿瘤的发展密切相关 [5] ，这为确定p15作为一个新的抑癌基因提供了证据。p15的抑癌机制与细胞周期调控密切相关，人们将细胞周期驱动机制比做一辆汽车或引擎，驱使其运行的因素好似“油门”，制动其运行的因素(CKI、Rb、p53)犹如“刹车” [1] 。CDK4/cyclinD与CDK6/cyclinD通过使Rb蛋白磷酸化后释放转录因子E2F，刺激与增殖有关的基因转录，CKI分子作为细胞周期调控体系中的重要成员，能直接与CDK-C
, 百拇医药
yclin复合物结合，抑制它们的激活，属于直接“刹车”，决定了它们在防止细胞转化的细胞癌变方面起了不可替代的作用，“刹车”失灵，细胞生长必将失控，而p15基因编码的产物p15蛋白与CyclinD1竞争性结合CDK4/6抑制其活性，主要作用于晚G 1 期，因此p15能够使细胞周期在G1/S转换中 停滞，对细胞周期起负调控作用，故p15基因的失活可能与肿瘤的发生发展有关。
以往的研究发现缺失与突变并不是p15基因表达失活的主要机制，目前已证实DNA甲基化是肿瘤细胞中抑癌基因失活的另一重要原因，在多种肿瘤细胞中都有p15基因启动子区CpG岛异常高甲基化的报道 [6] 。并且甲基化的水平也存在着组织差异，如在急性白血病中p15基因启动子区CpG岛异常高甲基化达80% [7] 。在胃癌组织中的报道不一，Lee TL研究的54例胃癌组织中p15基因CpG岛甲基化达68.5% [8] ，而国内的报道仅为9% [9] 。
, 百拇医药
贲门癌是一种常见的恶性肿瘤之一，在我国北方贲门癌的发生与食管癌有着相似的地域分布 [10] 。近二十年来世界各地特别是美国和欧洲一些国家胃远侧部位肿瘤发生率呈显著下降趋势，而食管和胃交界部腺癌的发生率呈明显上升趋势 [1] 。贲门癌与胃远侧部位肿瘤在流行病学、发病因素、组织发生及临床特征等方面均存在较明显的不一致性。但是由于中晚期贲门癌与食管癌有相似的临床症状，以及肿瘤所造成的局部组织结构破坏而使对其起源识别造成困难，长期以来，贲门癌或被归类于胃癌，或被归类于食管癌，多数学者认为应将其作为一种独立的疾病来研究 [12] 。贲门癌预后较差，因此，对其癌变机制的研究有着重要的意义。
本实验采用MSP法对贲门癌患者的癌组织及癌旁组织p15基因甲基化进行了检测，结果显示:患者癌组织p15基因启动子区甲基化阳性率为18.1%，其中5例为半甲基化，与Eric Poe Xing，等报道的该地区食管癌患者甲基化水平近似[3] 。癌旁组织p15基因启动子区甲基化阳性率为5.6%，而所有正常胃粘膜组织均为非甲基化。Yan Nie等发现本地区食管癌癌前病变组织中p15基因甲基化率为19%，正常食管粘膜无甲基化改变 [13] 。以上结果提示河南贲门癌、食管癌高发区贲门癌不仅与食管癌的地域分布一致，还可能存在着相似的癌变机制。此外，在癌前病变组织中也检测到异常的甲基化，可能这一改变是贲门癌变的早期分子事件。
, 百拇医药
迄今，启动子区异常甲基化关闭p16，p15基因转录表达，导致细胞增殖周期失调在肿瘤的发生发展中起重要作用已经得到了广泛的认同 [14] 。Lois A等早在1995年对p15基因mRNA和蛋白检测发现其蛋白水平降低 [15] 。王立东等也在研究贲门癌p16基因表达时发现随着病变的加重表达阳性率呈明显下降趋势 [16] ，p15作为p16基因的同一类分子在许多情况下与其作用机制相似，那么在贲门癌变过程中p15基因的异常甲基化是否与表达有关系尚需进一步的深入研究。
参考文献
1 Hunter T，Pines J.Cyclins and cancerⅡ:cyclin D and CDK inhibitor come ofage.Cell，1994，79:573.
2 Wang LD，Stephanie TS，Zhou Q，et al.Changes in P53and cyclin D1protein levels and cell proliferation in diffeernt stages of human esophageal and gastric cardia carcinogenesis.Int J Cancr，1994，59:514.
, http://www.100md.com
3 Eric Poe Xing，Yang Nie，Yunlong Song，et al.Mechanisms of inactivaˉtion of p14 ARF ，p15 INK4b and p16 INK4A genes in human esophageal squaˉmous cell carcinoma.Clinical Cancer Res，1999，5:2704-2713.
4 Palmisano WA，Divine KK，Saccomanno G，et al.Predicting lung cancer by detecting aberrant promoter methylation in sputum.Cancer Res，2000，60:5954-5958.
5 Stone S，Dayananth P，Jing P，et al.Genomic stucture，expression and mutational analysis of the p15(MTS2)gene.Oncogene，1995，11(5):987-991.
, http://www.100md.com
6 James G，Herman，Jin Jen，et al.Hypermethylation-associated inactive indicates a tumor supressor role for p15INK4B.Cancer Res，1996，56:722-727.
7 张雨生，楼方定，于力.采用甲基化特异性聚合酶链反应研究急性白血病p15基因CpG岛甲基化.中华血液学杂志，1999，20:12.
8 Lee TL，Leung WK，Chan MW，et al.Detection of gene promoter hyperˉmethylation in the tumor and serum of patients with gastric carcinoma.Clin Cancer Res，2002，8(6):1761-1766.
9 杨宇霞，孔祥东，张思仲.原发胃癌中p16和p15基因表达及甲基化异常。基础医学与临床，2002，22(4):318.
, 百拇医药
10 Li JY，Ershow AG，Chen ZJ，et al.Acase control studies of cancer of the esophageal and gastric cardia in Linxian.Int J Cancer，1989，43:755-781.
11 Blot WJ，Devesa SS，Kneller RW，et al.Rising incidence of adenocarciˉ noma of the esophagus and gastric cardia.JAMA，1991，265:1287-1289.
12 Botterweck AA，Schouten LJ，Volovics A，et al.Trends in incidence of adenocarcinaoma of the esophageal and gastric cardia in ten European countries.International Journal of Epidemiology，2000，29:645-654.
, 百拇医药
13 周琦，王立东.贲门癌的生物学特征.华人消化杂志，1998，6(7):636-637.
14 Yan Nie，Jie Liao，Xin Zhao，et al.Detection of multiple gene hyˉpeymethylation in the development of esophageal squamous cell carciˉnoma.Carcinogenesis，1999，(5):2704-2714.
15 Rocco JW，Sidransky D.P16INK4a in cancer progression.Exp Cell Res，2001，10，264(1):42-45.
16 Lois AF，Cooper LT，Geng Y，et al.Expression of p16and p15cylin-dependentkinase inhibitos in lymphocyte activation and neuronal difˉferentiation.CancerRes，1995，55(18):4010-4013.
, 百拇医药
17 王立东，李晓芳，周琦，等.贲门癌前病变组织和蛋白的表达.河南医科大学学报，1997，32(1):55-57.
ˇ 基金项目:国家自然科学基金(编号:39770296)
国家杰出青年科学基金(编号:30025016)
作者单位:1450052河南郑州大学医学院癌症研究室
2457000河南省濮阳市人民医院
3456592河南省林州市姚村食管癌医院病理科
△ 通讯作者Emial:lidong0823@sina.com
(编辑曲 全), 百拇医药
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)08-0693-03
Analysis on the methylation of p15gene in gastric cardia cancer from the subjects at high-incidence area for gastric cardia cancer in henan Xie Dongling，
, 百拇医药
Wang Lidong，Li Jixue，et al.
Laboratory for Cancer Research，College of Medicine，Zhengzhou University，Zhengzhou450052.
【Abstract】 Objective To explore the relationship between the aberrrant methylation of the p15gene CpG isˉlands and gastric cardia cancer.Methods The level of the methylation of p15gene CpG islands in76cases of gastric cardiac cancer and matching adjacent non-cancer tissue and normal tissue were analysised by using methylation-specific PCR methods.Results p15gene CpG islands aberrant methylation were detected in18.1%gastric cardia cancer while were methylated in4cases(5.6%)adjacent non-cancer tissue and unmethylated in all normal issue.Conclusionp15gene can be inactived by CpG islands aberrant methyation，which perhaps actsan important role in the carcinogenesis of gastric cardia cancer.The relationship of methylation and p15gene expression remain to be furˉther studied.
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Key words gastric cardical cancer p15gene methyation MSP DNA
甲基化是哺乳动物最普遍的一种基因外调节方式，是Epigenetics(表遗传学或拟遗传学)上研究最深入的一种机制，现已确切证明DNA甲基化与肿瘤的发生发展密切相关。p15是近年来发现的一类CKI分子(cyclin dependent kinase inhibitor，CKI细胞周期引擎分子的抑制剂)之一，能特异地与cylinD/CDK4或cylinD/CDK6结合并阻抑它们的活性，作为细胞生长负调节因子，控制细胞G 1 /S期的转移 [1] 。本文针对p15基因启动子区设计引物，对经过化学修饰的DNA进行PCR扩增，探讨p15甲基化与贲门癌变的关系。
1 材料与方法
1.1 材料 本研究所采用组织材料均来自河南贲门癌高发区林州市当地居民，包括76例贲门癌癌组织、相应癌旁组织以及远癌正常胃粘膜，所有标本参照组织病理学论断标准病理证实 [2] 。其中男53例，女23例，平均年龄56岁。所有患者术前均未接受化疗和放疗。
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1.2 DNA的制备 每例分别取癌、癌旁3cm新鲜冰冻组织
以及远癌正常胃粘膜各10mg，置于研磨器中加入液氮研成细沫状态，DNA提取采用Gentra公司的Puregene TMDNAIsoˉlation Kit，操作按说明书进行。提取的DNA用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测，所有样品均有DNA亮带。
1.3 甲基化特异性PCR(MSP) 在亚硫酸氢盐的作用下，所有未甲基化的胞嘧啶发生脱氨基反应转变成了尿嘧啶，但是5-甲基胞嘧啶不发生转变。因此，如果DNA原始甲基化情况不同，处理后DNA序列将不一样。经过化学修饰的DNA进行PCR扩增，甲基化特异引物可以扩增修饰前有甲基化的DNA，而非甲基化引物对这样的DNA不能扩增出条带。相反，非甲基化引物可以扩增修饰前没有甲基化的DNA，而甲基化对这样的DNA不能扩增出条带。根据上面的原理，就可以由引物判断原来DNA的甲基化状态。在实际操作中常常会有甲基化与非甲基化条带同时出现的情况，这是因为在异常甲基化的细胞中掺杂了正常的或炎性的没有甲基化的细胞，或者是肿瘤细胞中的一个等位基因发生了甲基化而另一个没有甲基化，称之为半甲基化状态(Hemi-methylation)。
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1.3.1 DNA修饰 本实验采用Intergen公司的CpGenome TM DNAModification Kit对DNA进行甲基化修饰，操作步骤按说明书进行。
1.3.2 引物 PCR引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。引物参考文献 [3] ，上游引物在288碱基处，下游引物在458碱基处。甲基化上游引物为5′-GAT CGG TCG TTC GGTTATTG-3′，下游引物为5′-CTT ATT CTC CTC GCG CATTC-3′，扩增片段约为207bp;非甲基化上游引物为5′-GTT GTT TGG TTA TTG TAT GGG-3′，下游引物为5′-CCC TTA TTC TCC TCACAC AT-3′，扩增片段约为204bp。
1.3.3 PCR扩增 扩增反应总体积为25μl:10×Buffer(100mM Tris-HCl pH8.8，500mM KCl，0.8%Nonidet P40)，25mMMgCl 2 (购自MBI Fermentas公司)，2.5mMdNTP(each)，5%DMSO，上下游引物各反10pmol，2UTaq DNA Polymerase(20mM Tris-HCl pH8.8，1mM DTT，0.1mM EDTA，100mM KCl，0.5%Nonidet P40，0.5%Tween20，50%Glycerol)，100ng DNA。反应采用touchdown PCR:95℃预变性5min，95℃30s，65℃30s，72℃30s，之后每个循环递减0.5℃，共30个循环，72℃延伸10min。为了保证检测的可靠性，以经过SssI甲基转移酶处理过的胎盘DNA作为p15基因启动子甲基化的阳性对照 [4]。以双蒸水代替模板作为阴性对照，扩增产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳(50V，30min)，EB染色，紫外灯下拍照。
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2 结果
贲门癌及癌旁组织甲基化水平检测结果。72例癌组织中有13例甲基化阳性，占18.1%，基中半甲基化5例;癌旁组织中有4例甲基化阳性，占5.6%，基中半甲基化3例;20例正常胃粘膜组织均为非甲基化。
图1 MSP检测贲门癌及癌旁组织中p15基因甲基化状态1:DNA标准分子量DL20000;3、5、7:甲基化扩增产物，其中5为阳性对照;2、4、6、8:非甲基化扩增产物
3 讨论
p15基因是p16家族成员之一，定位于染色位9p21的肿瘤敏感区域。大量肿瘤以及多种癌细胞系中的调查表明，p15基因的异常表达(如缺失、突变和重排等)在许多肿瘤及癌细胞系中存在，并与其中一些肿瘤的发展密切相关 [5] ，这为确定p15作为一个新的抑癌基因提供了证据。p15的抑癌机制与细胞周期调控密切相关，人们将细胞周期驱动机制比做一辆汽车或引擎，驱使其运行的因素好似“油门”，制动其运行的因素(CKI、Rb、p53)犹如“刹车” [1] 。CDK4/cyclinD与CDK6/cyclinD通过使Rb蛋白磷酸化后释放转录因子E2F，刺激与增殖有关的基因转录，CKI分子作为细胞周期调控体系中的重要成员，能直接与CDK-C
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yclin复合物结合，抑制它们的激活，属于直接“刹车”，决定了它们在防止细胞转化的细胞癌变方面起了不可替代的作用，“刹车”失灵，细胞生长必将失控，而p15基因编码的产物p15蛋白与CyclinD1竞争性结合CDK4/6抑制其活性，主要作用于晚G 1 期，因此p15能够使细胞周期在G1/S转换中 停滞，对细胞周期起负调控作用，故p15基因的失活可能与肿瘤的发生发展有关。
以往的研究发现缺失与突变并不是p15基因表达失活的主要机制，目前已证实DNA甲基化是肿瘤细胞中抑癌基因失活的另一重要原因，在多种肿瘤细胞中都有p15基因启动子区CpG岛异常高甲基化的报道 [6] 。并且甲基化的水平也存在着组织差异，如在急性白血病中p15基因启动子区CpG岛异常高甲基化达80% [7] 。在胃癌组织中的报道不一，Lee TL研究的54例胃癌组织中p15基因CpG岛甲基化达68.5% [8] ，而国内的报道仅为9% [9] 。
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贲门癌是一种常见的恶性肿瘤之一，在我国北方贲门癌的发生与食管癌有着相似的地域分布 [10] 。近二十年来世界各地特别是美国和欧洲一些国家胃远侧部位肿瘤发生率呈显著下降趋势，而食管和胃交界部腺癌的发生率呈明显上升趋势 [1] 。贲门癌与胃远侧部位肿瘤在流行病学、发病因素、组织发生及临床特征等方面均存在较明显的不一致性。但是由于中晚期贲门癌与食管癌有相似的临床症状，以及肿瘤所造成的局部组织结构破坏而使对其起源识别造成困难，长期以来，贲门癌或被归类于胃癌，或被归类于食管癌，多数学者认为应将其作为一种独立的疾病来研究 [12] 。贲门癌预后较差，因此，对其癌变机制的研究有着重要的意义。
本实验采用MSP法对贲门癌患者的癌组织及癌旁组织p15基因甲基化进行了检测，结果显示:患者癌组织p15基因启动子区甲基化阳性率为18.1%，其中5例为半甲基化，与Eric Poe Xing，等报道的该地区食管癌患者甲基化水平近似[3] 。癌旁组织p15基因启动子区甲基化阳性率为5.6%，而所有正常胃粘膜组织均为非甲基化。Yan Nie等发现本地区食管癌癌前病变组织中p15基因甲基化率为19%，正常食管粘膜无甲基化改变 [13] 。以上结果提示河南贲门癌、食管癌高发区贲门癌不仅与食管癌的地域分布一致，还可能存在着相似的癌变机制。此外，在癌前病变组织中也检测到异常的甲基化，可能这一改变是贲门癌变的早期分子事件。
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迄今，启动子区异常甲基化关闭p16，p15基因转录表达，导致细胞增殖周期失调在肿瘤的发生发展中起重要作用已经得到了广泛的认同 [14] 。Lois A等早在1995年对p15基因mRNA和蛋白检测发现其蛋白水平降低 [15] 。王立东等也在研究贲门癌p16基因表达时发现随着病变的加重表达阳性率呈明显下降趋势 [16] ，p15作为p16基因的同一类分子在许多情况下与其作用机制相似，那么在贲门癌变过程中p15基因的异常甲基化是否与表达有关系尚需进一步的深入研究。
参考文献
1 Hunter T，Pines J.Cyclins and cancerⅡ:cyclin D and CDK inhibitor come ofage.Cell，1994，79:573.
2 Wang LD，Stephanie TS，Zhou Q，et al.Changes in P53and cyclin D1protein levels and cell proliferation in diffeernt stages of human esophageal and gastric cardia carcinogenesis.Int J Cancr，1994，59:514.
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3 Eric Poe Xing，Yang Nie，Yunlong Song，et al.Mechanisms of inactivaˉtion of p14 ARF ，p15 INK4b and p16 INK4A genes in human esophageal squaˉmous cell carcinoma.Clinical Cancer Res，1999，5:2704-2713.
4 Palmisano WA，Divine KK，Saccomanno G，et al.Predicting lung cancer by detecting aberrant promoter methylation in sputum.Cancer Res，2000，60:5954-5958.
5 Stone S，Dayananth P，Jing P，et al.Genomic stucture，expression and mutational analysis of the p15(MTS2)gene.Oncogene，1995，11(5):987-991.
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6 James G，Herman，Jin Jen，et al.Hypermethylation-associated inactive indicates a tumor supressor role for p15INK4B.Cancer Res，1996，56:722-727.
7 张雨生，楼方定，于力.采用甲基化特异性聚合酶链反应研究急性白血病p15基因CpG岛甲基化.中华血液学杂志，1999，20:12.
8 Lee TL，Leung WK，Chan MW，et al.Detection of gene promoter hyperˉmethylation in the tumor and serum of patients with gastric carcinoma.Clin Cancer Res，2002，8(6):1761-1766.
9 杨宇霞，孔祥东，张思仲.原发胃癌中p16和p15基因表达及甲基化异常。基础医学与临床，2002，22(4):318.
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10 Li JY，Ershow AG，Chen ZJ，et al.Acase control studies of cancer of the esophageal and gastric cardia in Linxian.Int J Cancer，1989，43:755-781.
11 Blot WJ，Devesa SS，Kneller RW，et al.Rising incidence of adenocarciˉ noma of the esophagus and gastric cardia.JAMA，1991，265:1287-1289.
12 Botterweck AA，Schouten LJ，Volovics A，et al.Trends in incidence of adenocarcinaoma of the esophageal and gastric cardia in ten European countries.International Journal of Epidemiology，2000，29:645-654.
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13 周琦，王立东.贲门癌的生物学特征.华人消化杂志，1998，6(7):636-637.
14 Yan Nie，Jie Liao，Xin Zhao，et al.Detection of multiple gene hyˉpeymethylation in the development of esophageal squamous cell carciˉnoma.Carcinogenesis，1999，(5):2704-2714.
15 Rocco JW，Sidransky D.P16INK4a in cancer progression.Exp Cell Res，2001，10，264(1):42-45.
16 Lois AF，Cooper LT，Geng Y，et al.Expression of p16and p15cylin-dependentkinase inhibitos in lymphocyte activation and neuronal difˉferentiation.CancerRes，1995，55(18):4010-4013.
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17 王立东，李晓芳，周琦，等.贲门癌前病变组织和蛋白的表达.河南医科大学学报，1997，32(1):55-57.
ˇ 基金项目:国家自然科学基金(编号:39770296)
国家杰出青年科学基金(编号:30025016)
作者单位:1450052河南郑州大学医学院癌症研究室
2457000河南省濮阳市人民医院
3456592河南省林州市姚村食管癌医院病理科
△ 通讯作者Emial:lidong0823@sina.com
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